Im Praktikum wird die Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1) von Saccharomyces cerevisiae in E. coli BL21(DE3) und Pichia pastoris X-33 rekombinant hergestellt. Die native ADH1 (accession number: NC_001147.6) hat ein Molekulargewicht von 37 kDa. Die ADH aus beiden Expressionsstämmen wird mit einem N-terminalen His-Tag für die erleichterte Reinigung über eine Ni-NTA-Säule aufgereinigt und die Aktivität wird bestimmt und verglichen. Für die Klonierungsstrategie wird die ADH-Sequenz in den Vektor pET28a für E. coli und in den Vektor pPICZ A für P.pastoris kloniert. Der Ligaseansatz pET28a-ADH und der Ligaseansatz pPICZA-ADH werden in E. coli BEB 10-beta für die Gewinnung der rekombinanten Plasmide transformiert. Bei korrekter Bestätigung des Inserts (ADH-Sequenz im Vektor integriert) kann das Plasmid in den entsprechenden Expressionsstamm transformiert werden. Für die Proteinbildung erfolgt die Induktion mit IPTG bei E. coli BL21(DE3) und mit Methanol bei Pichia pastoris X33.
.
- ZHAW Teacher: Andrea Baier (N Dozentin)
- ZHAW Teacher: Gottfried Dasen (N Dozent)
- ZHAW Teacher: David Frasson (N Wiss. Mitarbeiter)
- ZHAW Teacher: Patrick Hauswirth (N Wiss. Mitarbeiter)
- ZHAW Teacher: Martin Sievers (N Dozent)
- ZHAW Teacher: Tobias Wermelinger (N Wiss. Mitarbeiter)
